丙二醛（MDA）測試盒（TBA 法）

（貨號:A003-1 TBA 法）

本試劑盒是在國內(nèi)外眾多測試方法的基礎上改進的一種微量、快速、簡便、準

確、對操作人員健康無損害的測試方法。通過測試可反映出血清（漿）、乳汁等細胞

外液、紅細胞、白細胞、培養(yǎng)細胞以及各種動植物的細胞水平及亞細胞水平的脂質

過氧化物的量。

一、測定意義：

機體通過酶系統(tǒng)與非酶系統(tǒng)產(chǎn)生氧自由基，后者能攻擊生物膜中的多不飽和脂

肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA），引發(fā)脂質過氧化作用，并因此形成脂質過

氧化物。如：醛基（丙二醛 MDA）、酮基、羥基、羰基、氫過氧基或內(nèi)過氧基，以

及新的氧自由基等。脂質過氧化作用不僅把活性氧轉化成活性化學劑，即非自由基

性的脂類分解產(chǎn)物，而且通過鏈式或鏈式支鏈反應，放大活性氧的作用。因此，初

始的一個活性氧能導致很多脂類分解產(chǎn)物的形成，這些分解產(chǎn)物中，一些是無害的，

另一些則能引起細胞代謝及功能障礙，甚至死亡。氧自由基不但通過生物膜中多不

飽和脂肪酸（PUFA）的過氧化引起細胞損傷，而且還能通過脂氫過氧化物的分解產(chǎn)

物引起細胞損傷。因而測試 MDA 的量常?？煞从硻C體內(nèi)脂質過氧化的程度，間接

地反映出細胞損傷的程度。

MDA 的測定常常與 SOD 的測定相互配合，SOD 活力的高低間接反應了機體清

除氧自由基的能力，而 MDA 的高低又間接反應了機體細胞受自由基攻擊的嚴重程

度，通過 SOD 與 MDA 的結果分析有助于醫(yī)學、生物學、藥理及工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展。

二、測試原理：

過氧化脂質降解產(chǎn)物中的丙二醛 （MDA）可與硫代巴-比妥酸 (TBA) * 縮合，

形成紅色產(chǎn)物,在 532nm 處有吸收峰。因底物為硫代巴-比妥酸（Thibabituric Acid

TBA）所以此法稱 TBA 法。

三、測試所需儀器設備：

可見光分光光度計或酶標儀，可調(diào)到 95℃左右的恒溫水浴箱或沸水鍋，離心機，

10mL 離心管。

四、試劑盒組成與配制(50 管/48 樣 A003-1-1)：

試劑一：液體 10mL×1 瓶，室溫保存。（天冷時會凝固，每次測試前可 37℃加熱

以加速溶解，直至透明方可應用）。

試劑二：液體 6mL×1 瓶，用時每瓶加 170mL 蒸餾水混勻，4℃冷藏。（注意不

要碰到皮膚上）。

試劑三：粉劑×1 支，用時將粉劑加蒸餾水 30mL，加熱到 90℃～100℃充分溶解

后用蒸餾水補足至 30mL，再加冰醋酸 30mL，混勻，配好的試劑避光

冷藏。

標準品：10nmol/mL 四乙氧基丙烷 5mL×1 瓶，4℃冷藏。

［注］：冰醋酸（分析純，乙酸濃度≥99.5%）；測試盒冷藏至少可保存一年。

五、試劑盒組成與配制（100 管/96 樣 A003-1-2）：

試劑一：液體 20mL×1 瓶，室溫保存。（天冷時會凝固，每次測試前可 37℃加熱

以加速溶解，直至透明方可應用）。

試劑二：液體 12mL×1 瓶，用時每瓶加 340mL 蒸餾水混勻，4℃冷藏（注意不

要碰到皮膚上）。

試劑三：粉劑×1 支，用時將粉劑加蒸餾水 60mL，加熱到 90℃～100℃充分溶解

后用蒸餾水補足至 60mL，再加冰醋酸 60mL，混勻，配好的試劑避光

冷藏。

標準品：10nmol/mL 四乙氧基丙烷 5mL×1 瓶，4℃冷藏。

［注］：冰醋酸（分析純，乙酸濃度≥99.5%）；測試盒冷藏至少可保存一年。

六、操作步驟：

1、操作表：

離心管蓋上蓋，用針在蓋上扎一小孔，旋渦混勻器混勻，95℃水?。ɑ蛴缅侀_

蓋煮沸）40 分鐘，取出后流水冷卻，然后 3500～4000 轉/分，離心 10 分鐘，（3000

轉/分以下離心時間需延長，目的使沉淀）。取上清***，532nm 處，1cm 光徑，

蒸餾水調(diào)零，測各管吸光度值。

[注]：a*：表示所取的樣品量、標準品量、無水乙醇的量、試劑一的量，四者均相等。

（a*一般取 0.1-0.2mL）

例如樣品取 0.1mL 則標準品、無水乙醇、試劑一也取 0.1mL，若樣品取

0.2mL 則標準品、無水乙醇及試劑一也取 0.2mL。因吸光度與加樣量呈正

比曲線，故結果不受影響。

** 一般情況下，標準管、空白管及對照管每批只需做 1～2只，若樣本不存在

溶血、脂血現(xiàn)象，則對照管可以不測，用空白管來代替對照管。

*** 吸取上清比色時用移液器吸取上清加入比色皿中，盡量避免傾倒，以

免沉淀進入比色皿，影響吸光度。

2、參考取樣量：血清（漿）取 0.1～0.2mL。低密度脂蛋白懸液取 0.1～0.2mL 。食

油取 0.03mL。肝組織、心肌、肌肉組織、螺旋藻等，取 5％或 10%

勻漿 0.1～0.2mL 較好。

3、標準管參考吸光度：當標準品取樣量為 0.1mL 時，則分光光度計測定標準管吸

光度減去空白管的吸光度為 0.065～0.070（酶標儀測定取 200μl 讀數(shù)時為 0.04

左右）。當標準品取樣量為 0.2mL 時，則標準管吸光度減去空白管的吸光度為

0.130～0.140（酶標儀測定取 200μl 讀數(shù)時為 0.08 左右）。

4、規(guī)范操作方法及簡便操作方法中，若發(fā)現(xiàn)檢測樣本吸光度太低，可以將水浴時間

40 分鐘延長至 80 分鐘，但您的同一課題中 MDA 的檢測都必須延長至 80 分鐘，

以免造成批間差異。

以免沉淀進入比色皿，影響吸光度。

[注 2]：以上規(guī)范操作法及簡便操作法適用于人及各種動植物的樣本（包括血清、動

植物組織及體液、細胞及細胞培養(yǎng)液等）。

[注 3]：規(guī)范操作方法及簡便操作方法中，若發(fā)現(xiàn)檢測樣本吸光度太低，可以將水浴

時間 40 分鐘延長至 80 分鐘，但您的同一課題中 MDA 的檢測都必須延長至

80 分鐘，以免造成批間差異。

（一）、樣本前處理見實驗方法學中的組織勻漿處理，可制成 10%或 5%的勻漿，

但要注意，因樣本量很少，所以做好的組織勻漿不要離心,例如培養(yǎng)

的細胞等破碎后可以不離心。取樣時注意要搖勻后立即取樣。

（二）、試劑組成與配制：

1、(100 管)微量操作法中的試劑三配制如下：

①、按規(guī)范操作方法來配制 MDA 3 號試劑：將 1 支 MDA 3 號粉劑倒入燒杯

內(nèi)加 90℃～100℃的熱蒸餾水 64mL*，充分溶解（溶解過程中可適當加熱）。

冷卻后加冰醋酸 60mL 混勻。

②、再將上述配好的 MDA 3 號試劑用 50%冰醋酸**按 2:1 進行稀釋，用多少配

多少。例如您需要用微量法測 MDA 需要試劑三為 15mL，則可以取上述按規(guī)

范操作法配好的試劑三 10mL 加 50%冰醋酸 5mL，混勻即可。配好的試劑避

光 4℃冰箱冷藏（冰醋酸自備）。

［注］：* 因蒸餾水熱脹冷縮，加熱過程要蒸發(fā)，本應加 60mL，現(xiàn)多加 4mL，

冷卻后在 60mL。

** 50%冰醋酸的配制是 50mL 蒸餾水加 50mL 冰醋酸混合而成的。

*** 冰醋酸又名乙酸，分析純，乙酸濃度≥99.5%。

2、(50 管)微量操作法中的試劑三配制如下：

①、按規(guī)范操作方法來配制 MDA 3 號試劑：將 1 支 MDA 3 號粉劑倒入燒杯內(nèi)

加 90℃～100℃的熱蒸餾水 32mL*，充分溶解（溶解過程中可適當加熱）。

冷卻后加冰醋酸 30mL 混勻。

②、再將上述配好 MDA 3 號試劑用 50%冰醋酸按 2:1 進行稀釋，用多少配多少。

例如您需要用微量法測 MDA 需要試劑三為 15mL，則可以取上述按規(guī)范操作

法配好的試劑三 10mL 加 50%冰醋酸 5mL，混勻即可。配好的試劑避光 4℃

冰箱冷藏（冰醋酸自備***）。

［注］：* 因蒸餾水熱脹冷縮，加熱過程要蒸發(fā)，本應加 30mL，現(xiàn)多加 2mL，

冷卻后在 30mL。

** 50%冰醋酸的配制是 50mL 蒸餾水加 50mL 冰醋酸混合而成的。

*** 冰醋酸又名乙酸，分析純，乙酸濃度≥99.5%。

（三）、操作步驟：

離心管蓋上蓋，用針在蓋上扎一小孔，旋渦混勻器混勻，95℃水?。ɑ蛴缅侀_

蓋煮沸）40 分鐘，取出后流水冷卻，然后 3500～4000 轉/分，離心 10 分鐘，（3000

轉/分以下離心時間需延長，目的使沉淀）。取上清***，532nm 處，1cm 光徑，

蒸餾水調(diào)零，測各管吸光度值。

a*表示所取的樣品量、標準品量、無水乙醇的量、試劑一的量，四者均相等。例如

樣品取 0.1mL 則標準品、無水乙醇及試劑一也取 0.1mL，若樣品取 0.2mL 則標準品、

無水乙醇及試劑一也取 0.2mL。因吸光度與加樣量呈正比曲線，因而結果不受影響。

** 一般情況下，標準管、空白管及對照管每批只需做 1～2 只，若樣本不存

在溶血、脂血現(xiàn)象，則對照管可以不測，用空白管來代替對照管。

*** 吸取上清比色時用移液器吸取上清加入比色皿中，盡量避免傾倒，以免

沉淀進入比色皿，影響吸光度。

注 1 ：用此方法所測各管吸光度值比規(guī)范操作方法要高，但不影響最終結果。

注 2 ：5%組織勻漿 a*取 0.1～0.2mL 進行檢測較好。

注③：若發(fā)現(xiàn)檢測樣本吸光度太低，可以將水浴時間 40 分鐘延長至 80 分鐘，

但您的同一課題中 MDA 的檢測都必須延長至 80 分鐘，以免造成批間

差異。

注④：此方法標準管參考吸光度：當標準品取樣量為 0.1mL 時，則標準管吸光

度減去空白管吸光度為 0.103～0.112。當標準品取樣量為 0.2mL 時，則

標準管吸光度減去空白管吸光度為 0.206～0.224。

(四)、計算公式及舉例：

樣本、試劑一為相同量。

** 一般情況下，標準管、空白管及對照管每批只需做 1～2 只，若樣本不存在溶血、

脂血現(xiàn)象，則對照管可以不測，用空白管來代替對照管。

*** 吸取上清比色時用移液器吸取上清加入比色皿中，盡量避免傾倒，以免

沉淀進入比色皿，影響吸光度。

2、標準管參考吸光度：當標準品取樣量為 0.1mL 時，則分光光度計測定標準管

吸光度減去空白管的吸光度為 0.065～0.070（酶標儀測

定取 200μl 讀數(shù)時為 0.045 左右）。當標準品取樣量為

0.2mL 時，則標準管吸光度減去空白管的吸光度為

0.130～0.140（酶標儀測定取 200μl 讀數(shù)時為 0.1 左右）。

旋渦混勻器混勻，離心管口用保鮮薄膜扎緊，用針頭刺一小孔，95℃水?。ɑ?/span>

用鍋開蓋煮沸）80 分鐘，取出后流水冷卻，然后 3500～4000 轉/分，離心 10 分鐘，

（3000 轉/分以下離心時間需延長，目的使沉淀）。取上清***，532nm 處，1cm

光徑，蒸餾水調(diào)零，測各管吸光度值。

a*為樣本取樣量，標準品、無水乙醇、樣本量均相等，生理鹽水的量為樣本的兩

倍，試劑一的量為樣本的四倍。例如高脂血清取 0.1mL，則標準品，無水乙

醇取 0.1mL，生理鹽水取 0.2mL，試劑一取 0.4mL。

** 一般情況下，標準管、空白管及對照管每批只需做 1～2 只，若樣本不存在溶

血、脂血現(xiàn)象，則對照管可以不測，用空白管來代替對照管。

*** 吸取上清比色時用移液器吸取上清加入比色皿中,盡量避免傾倒，以免

沉淀進入比色皿，影響吸光度。

3、標準管參考吸光度：此方法標準管參考吸光度：當標準品取樣量為 0.1mL

時，則分光光度計測定標準管吸光度減去空白管的吸

光度為 0.113～0.122。當標準品取樣量為 0.2mL 時，

則分光光度計測定標準管吸光度減去空白管的吸光度

為 0.216～0.234。

離心管蓋上蓋，用針在蓋上扎一小孔，旋渦混勻器混勻，95℃水?。ɑ蛴缅侀_

蓋煮沸）80 分鐘，取出后流水冷卻，然后 3500～4000 轉/分，離心 10 分鐘，（3000

轉/分以下離心時間需延長，目的使沉淀）。取上清***，532nm 處，1cm 光徑，

蒸餾水調(diào)零，測各管吸光度值。

a* 為樣本取樣量，標準品、無水乙醇、樣本量均相等，試劑一的量為樣本的

三倍。例如高脂血清取 0.1mL，則標準品、無水乙醇取 0.1mL，試劑一取

0.3mL。

** 一般情況下，標準管、空白管及對照管每批只需做 1～2 只，若樣本不存

在溶血、脂血現(xiàn)象，則對照管可以不測，用空白管來代替對照管。

*** 吸取上清比色時用移液器吸取上清加入比色皿中，盡量避免傾倒，

以免沉淀進入比色皿，影響吸光度。

2、標準管參考吸光度：此方法標準管參考吸光度：當標準品取樣量為 0.1mL

時，則分光光度計測定標準管吸光度減去空白管的吸

光度為 0.114～0.123。當標準品取樣量為 0.2mL 時，

則分光光度計測定標準管吸光度減去空白管的吸光度

為 0.216～0.235。

十、紅細胞中的 MDA 檢測方法

（一）、微量紅細胞中的 MDA 檢測方法（樣本量少時用）

1、樣本前處理：（可用以下二種方法中的一種）

（1）、載玻片取全血，進行 MDA 測定：

如果您所需測的血樣很少又很珍貴，例如新生兒指血，或小老鼠的尾血，可采

用載玻片上滴加 1～2 滴肝素涂勻，60oC 以下烤干，或自然吹干。將以上采取的少

量血樣滴在有肝素的載玻片上，用微量加樣器取您所需的血量，再制備成 1︰99 的

溶血液。（即全血︰蒸餾水=1︰99）

（2）、玻璃微量采血管采集紅細胞及溶血液的制備：

①、用 20μl 的玻璃微量采血管取載玻片上的肝素抗凝全血 20μl 左右。將玻璃毛細采

血管置水平位，迅速取下吸球，將空隙長的一端放在酒精燈火焰的三分之一處

燒至透紅，管端變成圓球狀閉結為止。用尺測量并記錄血柱長度 a 厘米。用紙

將采血管卷好，然后將采血管封閉端朝下裝入離心管中，1500 轉/分離心 5～10

分鐘，取出后用小砂輪在血清與紅細胞分界處劃開掰斷（或用剪刀直接剪斷）。

將有紅細胞的開口端倒放入裝有 1mL 蒸餾水的離心管中，再以 1500 轉/分離心

5 分鐘，此時毛細管中的紅細胞沉淀于離心管底部，用鑷子從離心管中取出毛

細管丟棄后，將離心管放在混勻器上旋渦混勻制成溶血液。

離心管蓋上蓋，用針在蓋上扎一小孔，旋渦混勻器混勻，95℃水浴（或用鍋開

蓋煮沸）40 分鐘，取出后流水冷卻，然后 3500～4000 轉/分,離心 10 分鐘,（3000 轉

/分以下離心時間需延長，目的使沉淀）。取上清***，532nm 處，1cm 光徑，蒸

餾水調(diào)零，測各管吸光度值。

a* 表示所取的樣品量、標準品量、無水乙醇的量、試劑一的量，四者均相等。例如

樣品取 0.1mL 則標準品、無水乙醇、試劑一也取 0.1mL，若樣品取 0.2mL 則標

準品、無水乙醇及試劑一也取 0.2mL。因吸光度與加樣量呈正比曲線，因而結

果不受影響。

** 一般情況下，標準管、空白管及對照管每批只需做 1～2 只，若樣本不存在溶

血、脂血現(xiàn)象，則對照管可以不測，用空白管來代替對照管。

*** 吸取上清比色時用移液器吸取上清加入比色皿中,盡量避免傾倒,以免沉淀

進入比色皿,影響吸光度。

規(guī)范操作方法標準管吸光度：當標準品取樣量為 0.1mL 時，則分光光度計測定標準

管吸光度減去空白管的吸光度為 0.065～0.070（酶標儀測定 200μl 讀數(shù)時為 0.045

左右）。當標準品取樣量為 0.2mL時，則標準管吸光度減去空白管的吸光度為0.130～

0.140（酶標儀測定 200μl 讀數(shù)時為 0.1 左右）。

注：若發(fā)現(xiàn)檢測樣本吸光度太低，可以將水浴時間 40 分鐘延長至 80 分鐘，但您

的同一課題中 MDA 的檢測都必須延長至 80 分鐘，以免造成批間差異。

②、方法二:（微量法）（用此方法所測各管吸光度值比規(guī)范操作方法所得值要

高，但不影響最終結果。）

先將已經(jīng)按規(guī)范操作方法配好的 MDA3 號試劑用 50％的冰醋酸按 2︰1 稀釋，

例如將配好的 MDA3 號試劑 100mL，加 50%的冰醋酸 50mL,混勻。也可以用多少

配多少進行以下檢測。

（注：50%冰醋酸的配制是 50mL 蒸餾水加 50mL 冰醋酸混合而成的。）

離心管蓋上蓋，用針在蓋上扎一小孔，旋渦混勻器混勻，95℃水?。ɑ蛴缅侀_

蓋煮沸）40 分鐘，取出后流水冷卻,然后 3500～4000 轉/分，離心 10 分鐘，（3000 轉

/分以下離心時間需延長，目的使沉淀）。取上清***，532nm 處，1cm 光徑，蒸

餾水調(diào)零，測各管吸光度值。

a* 表示所取的樣品量、標準品量、無水乙醇的量、試劑一的量，四者均相等。例如

樣品取 0.1mL 則標準品、無水乙醇及試劑一也取 0.1mL，若樣品取 0.2mL 則標

準品、無水乙醇及試劑一也取 0.2mL。因吸光度與加樣量呈正比曲線，因而結

果不受影響。

** 一般情況下，標準管、空白管及對照管每批只需做 1～2 只，若樣本不存在溶血、

脂血現(xiàn)象，則對照管可以不測，用空白管來代替對照管。

*** 吸取上清比色時用移液器吸取上清加入比色皿中,盡量避免傾倒，以免沉

淀進入比色皿，影響吸光度。

注：若發(fā)現(xiàn)檢測樣本吸光度太低，可以將水浴時間 40 分鐘延長至 80 分鐘，但您的

同一課題中 MDA 的檢測都必須延長至 80 分鐘，以免造成批間差異。

此方法標準管參考吸光度：當標準品取樣量為 0.1mL 時，分光光度計測定標準

管吸光度減去空白管的吸光度為 0.103～0.112。當標準品取樣量為 0.2mL 時，分

光光度計測定標準管吸光度減去空白管的吸光度為 0.206～0.224。

3、取某濃度的溶血液進行血紅蛋白測定：

Hb 測定：取 100 倍濃縮的 Hb 測試液 1mL (本所有貨供應)，加水至 100mL 配

成應用測試液，取 1：x 血球溶血液 20μl 加稀釋好的 Hb 應用測試液

5mL, 充分混勻，靜置 5 分鐘，波長 540nm, 1cm 光徑，蒸餾水調(diào)零，

比色，記錄各管吸光度值。Hb 計算：將吸光度值乘以 367.7 即為

Hb 克數(shù)/升。如果血樣量特少時，則樣本量和試劑量均可減少一半

或按比例減少。

4、紅細胞中 MDA 的計算：

在旋渦混勻器上混勻 1 分鐘使細胞充分溶解。

③、抽提：在上述溶血液中加全血體積 2 倍的無水乙醇（0.3mL），(也可用 95%乙醇

代替)在旋渦混勻器上充分混勻 30 秒鐘。

④、沉淀蛋白：再加全血體積 2 倍的三氯-甲烷（0.3mL）置旋渦混勻器上混勻 1 分鐘，

然后 3000～3500 轉/分，離心 5～10 分鐘。此時液體分為三層，上層為 MDA

抽提液，中層為血紅蛋白沉淀物，下層為三氯-甲烷。取上清并記錄體積，約

0.9mL。

丙二醛（MDA）測試盒（TBA 法）